رفتن به بالا
  • پنج شنبه - ۴ دی ۱۳۹۳ - ۲۰:۳۸
  • کد خبر : ۲۵۳۱
  • چاپ خبر : فلوسیتومتری

فلوسیتومتری

فلوسیتومتر فلوسیتومتری یک تکنولوژی بیوفیزیک بر‌ اساس لیزر است که  برای جدا سازی ، شمارش سلول ، تشخیص بیومارکر و مهندسی پروتئین با عبوردادن سلول ها به صورت تک‌تک از مقابل لیزر استفاده می‌شود. این دستگاه ، امکان آنالیز چندپارامتری هم‌زمان مشخصه‌های شیمیایی و یا فیزیکی را تا هزاران ذره در هر ثانیه فراهم می‌کند. […]

فلوسیتومتر

فلوسیتومتری یک تکنولوژی بیوفیزیک بر‌ اساس لیزر است که  برای جدا سازی ، شمارش سلول ، تشخیص بیومارکر و مهندسی پروتئین با عبوردادن سلول ها به صورت تک‌تک از مقابل لیزر استفاده می‌شود. این دستگاه ، امکان آنالیز چندپارامتری هم‌زمان مشخصه‌های شیمیایی و یا فیزیکی را تا هزاران ذره در هر ثانیه فراهم می‌کند.

Flow Cytometry 01

هدف
فـلـوسـیـتـومـتـری بـه سرعت ، چندین جزء از سـلــول را بــه صــورت هـمــزمــان کـمــی کـرده و سلول‌ها و اجزای آن‌ها را در حالت محلول (به عـنـــوان مـثــال در خــون ، شـسـتـشــوی مـثــانــه ، یــا دیگـر مایعات بدن) می‌شمارد -یا در برخی از مـوارد از هـم جـدا مـی‌کند-‌ . کاربردهای بالینی فـلــوسـیـتــومتـرهـا شـامـل تشخیـص و شمـارش زیـرمـجـمـوعـه‌های  لنفوسیت T انسان و انجام شـمـارش‌های افتراقی سلول‌های سفید خون ، مـطـالـعـات اتوآنتی بادی پلاکت ، آنالیز نشانگر سـطــح سـلــول ، آنـالـیـز رتـیـکـولـوسـیـت و آنـالـیـز بــاکـتــریــایــی اســت. فـلــوسـیـتــومـتـرهـا همچنیـن آنیوپلوئیدی (هر گونه انحرافی از مضرب دقیقی از تعداد هاپلوئید کروموزوم ها ، چه کمتر و چه بیشتر) را با  اندازه گیری داخل سلولی و آنالیز DNA ،‌ تشخیص می‌دهند. 
پزشکان می‌توانند از نتایج این مطالعات در کنار داده‌های بالینی دیگر برای تشخیص و پیش بـیـنـی لـوسـمـی ، لـنـفوم ، اختلالات نقص ایمنی مـانـنـد عـفـونت HIV ، بیماری‌های خودایمنی و نــاهـنـجــاری‌هــای جـنـیـنـی و نـیـز بـرای ارزیـابـی مــوفـقـیــت فــرایـنــدهــای پـیــونــد اسـتـفــاده کـننـد. داده‌های فلوسیتومتری همچنین در تحقیقات ســـرطـــانـــی بــرای انــدازه‌گـیــری تـکـثـیــر ، انـجــام ســنــجــــش‌هــــای انــکــــوپــــروتــئــیــــن و ارزیـــابـــی مـقـــاومـــت‌هـــای داروئـــی اسـتـفــاده مــی‌شــونــد. فلوسیتومتری به صورت معمول در تشخیص اخـتـــلالات ، بـــه ویــژه ســرطــان خــون اسـتـفــاده مـــی‌شـــود ؛ امـــا کـــاربـــردهـــای زیــاد دیـگــری در تحقیقـات پایه ، عمل بالینی و آزمایشات بالینی هم دارد. یک کاربرد معمول آن مرتب کردن فیزیکی ذرات بر اساس خواص آن‌ها است به نحوی که جمعیت موردنظر خالص‌سازی شود.

تاریخچه
مختـرع اولین نمونه‌های فلوسیتومترهای امروزه به ویژه جدا کننده‌های سلول ، Mack Fulwyler بود. وی مقاله مرتبط با این موضوع را در ۱۹۶۵ منتشر کرد. اولین دستگاه فلوسیتومتر بر اساس فلورسنس در ۱۹۶۸ توسط Wolfgang Gohde از دانشگاه مونستر توسعه یافت. در آن زمان ، دانشمندان روش‌های جذبی را به روش‌های فلورسنس ترجیح می‌دادند. خیلی طول نکشید که دستگاه‌های فلوسیتومتر شامل سیتوفلوگراف توسعه یافتند. 

عنوان  فناوری
اسم اصلی فناوری فلوسیتومتر ، “سیتوفتومتری پالس” بود. در پنجمین کنفرانس بنیاد مهندسی امریکا روی سیتولوژی اتوماتیک در فلوریدا در ۱۹۷۶ توافق شد که همه از اسم فلوسیتومتر استفاده کنند و این نام به سرعت مرسوم شد.

اصول عملکرد
فلوسیتومتری شامل سه سیستم پایه است: جزء مایع که سلول‌ها را به محفظه آنالیز منتقل می‌کند ، سیستم نوری با وسایل تشخیص و آنالیز داده و اجزای نمایشگر (شکل ۱) یک پرتو نوری تک طول موج (معمولا نور لیزر) ، به سمت یک  جریان  مایع متمرکز شده به صورت هیدرودینامیک هدایت می‌شود. تعدادی آشکارساز پس از نقطه  برخورد جریان مایع  با لیزر قرار دارند: یکی  در امتداد  شعاع نوری (پراکنده کننده فروارد forward  scatter یا FSC) و چند تا عمود بر آن (پراکنده کننده جانبی side scatter یا SSC) و یک یا چند آشکارساز فلورسنس. هر ذره معلق با اندازه ۰/۲‌ تا ۱۵۰ میکرومتر که از شعاع نور عبور می‌کند ، نور لیزر را پراکنده می کند. مواد شیمیایی فلورسنت موجود در ذره یا متصل شده به آن ، می‌توانند تحریک شده و نوری با طول موج بیشتر از منبع نوری ساطع کنند. این ترکیب از نور فلورسنت و نور پراکنده شده ، توسط آشکارسازها و با تحلیل نوسانات  (یکی برای هر پیک انتشار فلورسنت) تشخیص داده می‌شود و سپس می‌توان انواع مختلفی از اطلاعات در مورد ساختار فیزیکی و شیمیایی هر ذره مجزا را استخراج کرد. FSC با حجم سلول همبسته است و SSC وابسته به پیچیدگی داخلی ذره (یعنی شکل هسته ، مقدار و نوع  دانه ها در سیتوپلاسم یا زبری غشا) است. چرا که نور در اثر برخورد با اجزای داخلی سلول پراکنده می‌شود. برخی از فلوسیتومترهای موجود در بازار ، نیاز به فلورسنس ندارند و تنها از پراکنده کننده‌های نور برای اندازه گیری استفاده می کنند. بیشتر فلوسیتومترها ، تصاویری از فلورسنس هر سلول ، نور پراکنده شده و نور منتقل شده تشکیل می‌دهند.

Flow Cytometry 02

ایمنوفلورسنس پایه اغلب سنجش‌های سیتومتریک فلو است. این تکنیک متکی بر اسـتـفــاده از رنـگ‌هـا و فلئـوروکـروم‌هـا (flurochromes) بـرای نشـانـه گـذاری کـردن ساختارهای خاص بر روی سلول است. فلئوروکروم  به اجزای خاصی در سلول مانند DNA ، RNA یا پروتئین‌ها (آنزیم‌های سلولی ، نشانگرهای سطح غشا ، دیگر آنتی ژن ها) متصل می شود. زمانی که در معرض نوری با طول موج خاص قرار می‌گیرند ، این فلئوروکروم‌ها ، فلورسنت می‌شوند و نور را با طول موج بیشتر از نور تابشی که جذب می‌کنند ، ساطع خواهند کرد. 
دو یـا چـند فلئوروکروم می‌توانند به صورت هم‌زمان برای برچسب گذاری  دو ترکیب سلولی (به عنوان مثال یکی برای برچسب گذاری DNA هسته و دیگری برای برچسب گذاری آنزیم‌های سیتوپلاسمی) استفاده شوند. به علاوه چند فلئوروکروم می‌توانند برای برچسب گذاری ماده سلولی مشابهی استفاده شوند. اجزای سلولی می‌توانند هم چنین با رنگ ametachromatic برچسب گذاری شوند.
سلول‌هایی که قرار است آنالیز شوند با معرف‌های خاصی ترکیب شده و سپس به صورت اتوماتیک در یک جریان مایع معلق می‌شوند. این جریان در یک محیط مایع تـحـت فـشـار بـه مـحـفـظـه آنـالـیـز مـنـتـقـل می‌شود. قبل از ورود به محفظه ، به صورت هـیـدرودیـنـامـیک متمرکز شده و یک جریان لایه ای و آرام ایجاد می کند. این باعث می‌شود که سلول‌ها به یک مسیر دقیقاً تک ‌سلولی از ناحیه سنجش نوری عبور کنند. در این ناحیه ، سیستم تشخیص ، هر سلول را با نرخ شمارش تا ۱۰ هزار سلول در ثانیه آنالیز می‌کند.
همین طور که سلول‌ها از محفظه آنالیز (فلوسل) عبور می‌ کنند ، یک پرتو نوری تک رنگ با چگالی بالا از یک لیزر به آن‌ها تابانده می‌شوند. طول موج تابیده شده توسط لیزر باید در بازه انرژی تحریکی رنگ/فلئوروکروم‌های انتخابی قرار بگیرد تا فلورسنت رخ دهد. مرسوم ترین لیزرها ، لیزرهای آرگون هستند که یک تابش قوی در طول موج nm488 می‌کنند. هلیم-نئون (nm 633) ، هلیم-کادیم (nm 325) و دیود قرمز (nm 635) انواع دیگری از لیزرها هستند که معمولا در فلوسیتومتری استفاده می‌شوند. 
علاوه بر انطباق انرژی ، مهم است که طول موج تابیده شده توسط لیزر از طول موج انـرژی فـلـورسـانـس قـابل تمیز باشد. (جدول ۱ را برای مشاهده لیستی از رنگ‌ها و fluorochromهای مرسوم ببینید.)

Flow Cytometry 03

هـمـیـن طـور کـه نـور از داخـل جـریـان  سـلـول‌هـا می‌گذرد ، دستگاه ، فلورسنس و پراکندگی نوری را که تابیده می‌شود اندازه گیری می کند. پراکندگی نور معیاری از مقدار نور لیزر منعکس شده و شکسته شده از طریق سلول در مقایسه با نور منتشر شده از رنگ‌های فلورسنت است. شدت پراکندگی نور در جهت  مقابل (fSc) معمولا متناسب با سایز سلول است ؛ در حالی که پراکندگی نور در زاویه عمود به نور تابیده شده ، معمولا با ساختارهای داخلی سلول (به عنوان مثال نسبت هسته به سیتوپلاسم ، دانه دانه بودن سیتوپلاسم) مرتبط است. پراکندگی نور می‌تواند برای تفکیک سلول‌های زنده از مرده در یک جمعیت همگن از لنفوسیت‌ها استفاده شود.
مجموعه نور فلورسنت ساطع شده از رشته نمونه معمولا در زاویه ۹۰ درجه نسبت به باریکه نور تابیده شده قرار دارد. تشخیص فلورسانس بر اساس اختصاصی بودن یک رنـگ فـلوورسنت به قسمت منحصربه فردی از سلول است. این تعامل به تحلیل و جـداسـازی زیـرجـمـعـیـت‌هـای لـنـفـوسـیـت ، انـدازه گـیـری زیـرمجموعه ای از جمعیت‌ لنفوسیت‌های T ، ارزیابی کینتیک سلولی در جمعیت‌های سلولی نئوپلاستیک و طبیعی ، انـــدازه گـیـــری آنـتـــی‌ژن‌هـــای سـطـحـــی سـلــول (نشـانگـرهای تومور ، گیرنده ها) ، و جداسازی سلـول‌هـا بر اساس مشخصه‌های غشای آن‌ها کمک می‌کند. 
فـلــوسـیـتــومـتــرهــای چـنــد لـیـزری در آنـالیـز سیگنال‌های فلورسانسی که از لحاظ طول موج تحریک جدا از هم هستند ، استفاده می شوند. در این حالت ، می توان سیگنال‌های جداگانه را با استفاده از نیمه آینه‌ها در جهات مختلف هدایت و ارسال کرد ، به نحوی که هیچ تداخل سیگنالی رخ ندهد. با این حال در برخی دستگاه‌ها زمانی کـه نور سلول را ترک می‌کند ، تمام سیگنال‌ها ترکیب می‌شوند. این متکی به چیدمان آینه‌های دورنگ نما (dichroic) و فیلترهای جداسازی و اصلاح سیگنال‌ها است. آینه‌های دورنگ‌نما بـرای منعکس کردن نور بالای یک طول موج خــاص و در عـیــن حــال ردکــردن نـور بـا طـول موج‌های پایین تر از آن حد ، طراحی شده‌اند. مــی‌تـوان همیـن طـور کـه نـور وارد لامـپ‌هـای تقویت‌کننده‌ نوری (pmt) می‌شود ، فیلتر کردن بیشتری را هم اعمال کرد. این آشکارسازهای pmt نــور ســاطــع شـده تـوسـط سـلـول‌هـا را بـه پالس‌های الکترونیکی تبدیل می‌کنند و سپس این پالس‌ها برای دیجیتال شدن و تحلیل‌های کامپیوتری ، تقویت می‌شوند.

Flow Cytometry 04

بـرخـی از فلوسیتومترها ، قابلیت جداسازی سلول (Sorting) را دارند و می‌توانند انواع خاصی از سلول‌ها در نمونه را جداسازی و تحلیل کنند. هــم‌زمــان بــا خــروج رشـتــه نـمــونــه از مـحـفظـه تــشــخــیـــص ، یـــک کـــریــســتــال پـیــزوالـکـتــریــک (کریستالی که در آن ، نیروی مکانیکی متناسب با ولتاژ اعمال شده تولید می‌شود) ، ارتعاش کرده و  جـریـان یـکـنواخت نمونه را به یک سری قطره تبدیل می کند که از بین دو صفحه انحراف قطبی شـده عـبور می‌کنند. بر اساس انتخاب از پیش تعیین شده ، سلول‌های مجزا که بار خالص مثبت یا بار خالص منفی دارند به سمت مخزن جمع آوری مــربــوطــه مـنـحــرف شـده و بـقـیـه مـایـع و سلول‌ها  دور ریخته می‌شوند.
یک نوع دیگر فلوسیتومتر جدا کننده سلول یک مکانیزم مکانیکی برای  جدا کردن دارد که در آن لوله گیرنده سلول هایی که خارج می شوند ، بـــه سـمـــت چـــپ و راســـت  حـــرکـــت کــرده و سلول‌های موردنظر را می گیرد. این نوع تکنولوژی مرتب سازی وابسته به تشکیل قطره نیست و در یک محیط بسته اتفاق می‌افتد و بنابراین تشکیل بخارات و ریسک آلودگی ناشی از نمونه‌های خطرناک بیو را کم می‌کند. 
فلوسیتومترهای مدرن می‌توانند چند هزار ذره را در هر ثانیه به صورت زمان حقیقی تحلیـل کننـد و می‌توانند به صورت فعال ، ذرات با ویژگی های خاص را جدا کنند. فلـوسیتومتر مشابه میکروسکوپ است ، با این تفاوت که به جای تولید تصویری از سلول ، به صورت اتوماتیک پارامترهای مجموعه با خروجی بالا (برای تعداد زیادی سلول) را کمی می‌کند. برای آنالیز بافت‌های جامد ، باید آن‌ها را ابتدا در حالت محلول تک سلولی آماده کرد.

Flow Cytometry 05
فلوسیتومتر پنج جزء اصلی دارد:
فلوسل: که سلول‌ها را در مایع هم راستا می‌کند ، به نحوی که به صورت تک به تک پشت سر هم از مسیر پرتو نوری عبور کنند.
سیستم اپتیکی و لیزر: که معمولا از سیستم‌های نوری و اندازه گیری امپدانس (یا هدایت) لامپ‌ها (جیوه ، زنون) ؛ لیزرهای با توان بالا و خنک شونده با آب (آرگون ، کریپتون ، لیزر رنگی) ؛ لیزرهای توان پائین خنک شونده با هوا (آرگون nm 488 ، هلیم-نئون قرمز nm 633 ، هلیم نئون سبز ، HeCd) UV)) ؛ لیزرهای دیودی (سبز ، قرمز ، بنفش و آبی) که سیگنال‌های نوری می‌دهند.
آشکارساز و سیستم تبدیل آنالوگ به دیجیتال: که FSC و SSC و نیز سیگنال‌های فلـورسنـس نـور را بـه سیگنال‌های الکتریکی (قابل پردازش توسط کامپیوتر) تبدیل می‌کنند.
یک سیستم تقویت الکترونیکی: خطی یا لگاریتمی
یک کامپیوتر برای آنالیز سیگنال ها

دریافت سیگنال سلول‌ها
جمع آوری سیگنال از نمونه‌ها با استفاده از فلوسیتومتر ، دریافت یا Acquisition نامیده می‌شود. دریافت ، به واسطه ی کامپیوتری که به صورت فیزیکی به فلوسیتومتر متصل شده است و نرم افزاری که واسطه دیجیتال با سیتومتر است ، انجام می‌شود. نرم‌افزار می‌تواند پارامترها (مانند ولتاژ ، جبرانسازی و غیره) را برای نمونه در حال تست تنظیم کند و همچنین برای اطمینان از این که پارامترها به صورت صحیح تنظیم شده اند ، می تواند در نمایش اطلاعات اولیه سلول همزمان با اخذ داده‌های سلول کمک کند. بطور کلی فلوسیتومترهای اولیه ، دستگاه‌های تجربی بودند ؛ اما پیشرفت‌های تکنولوژیک امکان اسـتفـاده وسیـع از آن‌هـا بـرای اهـداف بـالینـی و تحقیقاتی را فراهم کرده اند. به خاطر این توسعه ، بازار قابل توجهی مربوط به ابزار دقیق ، نرم افزار آنالیز و نیز معرف‌های مورد استفـاده در مـرحلـه دریـافـت مـاننـد آنتی بادی‌های برچسب گذاری شده به صورت فلورسنت ایجاد شده است.
دسـتـگـــاه‌هـــای مــدرن مـعـمــولا چـنــد لـیـزر و آشکارساز فلورسنس دارند. رکورد فعلی برای یک دستگاه تجاری چهار لیزر  و ۱۸ آشکارساز فـلــورسـنــس اســت. افــزایــش تـعــداد لـیــزرهــا و آشـکــارســازهــا ، امکـان بـرچسـب گـذاری چنـد آنتی‌بادی به صورت همزمان را فراهم می‌کند و مـی‌تـوانـد با دقت بیشتری جمعیت هدف را با مـارکـرهــای فـنـوتـیـپ آن‌هـا شنـاسـایـی کـنـــد. دسـتـگـــاه‌هــای خــاصــی حـتـی مـی‌تــوانـنــد از سلول‌های مجزا هم تصاویر دیجیتال تهیه کنند و بــه ایــن وسـیـلــه امـکــان آنــالـیــز مـکــان سـیـگـنـال فـلــورسـنــت داخــل یــا روی سطـح سلـول‌هـا را می‌دهد. 

آنالیز داده
داده تولیدشده با فلوسیتومترها را می‌توان با رسم یک هیستوگرام یک بعدی نمایش داد یا این که به صورت دو یا حتی سه بعدی رسم کـرد. نـواحـی روی این نمودارها را می‌توان بر اساس شــــدت فــلــــورســنــــس ، بــــا ایــجــــاد یـــک ســـری زیرمجموعه به نام gate به صورت متوالی جــدا کـــرد. پــروتکـل‌هـای خـاصـی بـرای ایجـاد gateها برای اهداف بالینی و تشخیصی به ویژه در رابطه با هماتولوژی وجود دارند.
نمـودارهـا اغلـب بـا مقیـاس لگـاریتمـی رسـم می‌شوند. از آنجا که طیف‌های تابشی نورهای فـلـورسـنـت مـخـتـلـف بـا هـم هـمـپـوشـانی دارند ، سـیـگـنـال‌هـا در آشـکـارسـازهـا بـایـد بـه صورت الکترونیکی و نیز محاسباتی جبرانسازی شوند. داده جمع آوری شده با استفاده از فلوسیتومتر را مـــی‌تـــوان بـــا نـــرم افــزارهــایــی مــانـنــد WinMDI (یـک نرم‌افزار رایگان) ، Flowjo ، FCS Express ، VenturiOne ، CellQuest Pro یا Cytospec تحلیل کرد. بعد از جمع آوری داده ، نیازی نیست که اتـصال به فلوسیتومتر باقی بماند. به این دلیل ، آنالیز معمولا روی یک کامپیوتر جداگانه انجام می‌شود.

آنالیز محاسباتی
پیشـرفـت‌هـای اخیـر در شنـاسـایی اتوماتیک جـمـعـیـــت سـلـــولـــی مـــورد نـظــر بــا اسـتـفــاده از روش‌های محاسباتی ، روش دیگری به عنوان جـایگـزیـن برای استراتژی سنتی gate پیشنهـاد مـــی‌کـنـنــد. سیستــم‌هـای شنـاسـایـی اتـومـاتیـک ، می‌توانند به یافتن جمعیت‌های پنهان و کمیاب کمک کنند.

برچسب‌ها
بـرچسـب‌هـای فلـورسنـت: بـازه وسیعـی از فلئـوروفـورهـا می‌توانند به عنوان برچسب در فلوسیتومتری استفاده شوند. فلئوروفورها یا به صورت ساده “فلئورها” ، معمولا به یک آنتی بادی متصل می‌شوند که یک ویژگی هدف را داخل یا روی سلول شناسایی می‌کند. همچنین می‌توانند به یک ذره شیمیایی که میل ترکیبی با غشای سلول یا ساختار دیگری در سلول دارد ، متصل شوند. هر فلئوروفور ، یک طول موج تابش و پیک تحریک خاص دارد و طیف‌های انتشار اغلب با هم همپوشانی دارند. در نتیجه ترکیب برچسب‌هایی که می‌توانند استفاده شوند ، وابسته به طول موج لامپ (ها) یا لـیــزر(هــا)ی مــورد اسـتـفــاده بــرای بــرانـگـیـخـتــن فـلـئــوروکــوروم‌هــا و نـیــز وابـستـه بـه آشکارسازهای موجود است. ماکزیمم تعداد برچسب‌های فلورسنت قابل تفکیک حـدود ۱۷ تـا ۱۸ عـدد است و این سطـح پیچیـدگـی بـاعـث مـی‌شـود نیـاز بـه بهینـه سـازی پـرزحـمتی برای محدودکردن اغـتـشــاشــات و نـیــز نـیــاز بــه الـگـوریتـم‌هـای deconvolution پیچیـده بـرای جـداسـازی طیف‌هایی که با هم تداخل دارند ، باشد.
نقاط کوانتومی: نقاط کوانتومی به خاطر پیک‌های انتشار باریک تر ، گاهی به جای فلئوروفورهای سنتی استفاده می‌شوند.
‌برچسب گذاری ایزوتوپ: یک روش برای غلبه بر محدودیت برچسب گذاری فلورسنت ، متصل کردن ایزوتوپ‌های لانتانیدها (lanthanide) به آنتی بادی‌ها است. این روش از نظر تئوری می‌تواند امکان استفاده از ۴۰ تا ۶۰ برچسب قابل تمایز را فراهم کند و عملا کاربری آن ، برای ۳۰ برچسب نشان داده شده است. سلول‌ها وارد پلاسما شـده ، یـونـیـزه می‌شوند و اسپکترومتری جرمی برای شناسایی ایزوتوپ‌های مرتبط استفاده می‌شوند. گرچه این روش امکان استفاده از تعداد بیشتری برچسب را فراهم می‌کند ، در حال حاضر ظرفیت عبوردهی کمتری نسبت به فلوسیتومتری سنتی دارد. همچنین سلول‌های آنالیزشده را از بین می برد و لذا امکان ریکاور کردن آن‌ها با جدا سازی وجود ندارد. 

پارامترهای اندازه گیری
در ادامه لیستی از این پارامترها نوشته شده است که البته دائماً این لیست در حال توسعه است:
– ‌تأیید تشخیص لوسمی لنفوسیتی مزمن
– ‌پیچیدگی مورفولوژیک و حجم سلول ها
– ‌رنگدانه‌های سلول مانند کلروفیل یا phycoerythrin
– ‌محتوای کلی  DNA سیکل سلولی ، کینتیک سلولی ، تکثیر ، پلوئیدی ، آنیوپلوئیدی و غیره)
– ‌محتوای کلی RNA
– ‌تغییرات تعداد کپی DNA (با تکنولوژی BACs-on-Beads یا Flow-FISH)
‌- مرتب سازی و آنالیز کروموزوم (ایجاد کتابخانه ، رنگ کردن کروموزوم)
‌- بخش بندی و بیان پروتئین
– ‌تغییرات پروتئین ، فسفوپروتئین ها
‌- مـحـصــولات تــراریـختـه (transgenic) در داخل بدن ، به ویژه پروتئین فلئورسنت سبز یا دیگر پروتئین‌های فلئورسنت مرتبط
– ‌آنتـی ژن‌هـای سطح سلول (خوشه ای از نشانگرهای افتراق (CD))
– ‌آنــتـــــی ژن‌هـــــای درون ســلــــولــــی (انــــواع cytokines ، واسطه‌های ثانویه ، غیره.)
– ‌آنتی ژن‌های هسته ای
– ‌فعالیت آنزیمی
– PH ، کـلـسـیـم یـونیـزه شـده داخـل سلـولـی ، منیزیم ، پتانسیل غشا
– ‌سیالیت غشا
– ‌آپوپتوز (کمی سازی ، اندازه گیری تخریب DNA ، پـتـانـسـیـل غـشـای مـیـتـوکندری ، تغییرات نفوذپذیری ، فعالیت (caspase)
– ‌زیست پذیری سلول
– ‌مــانـیـتــور کــردن نـفــوذپـذیـری الـکـتـریـکـی سلول‌ها
‌- بـــــررســـــی مـــشــخــصــــه‌هــــای مــقــــاومــــت چنددارویی (MDR) در سلول‌های سرطانی
– Glutathione
– تــــرکــیــبــــات ویــــروســــی (آنــتــــی ژن‌هـــای سطح/DNA ، غیره.)
– چــســبــنــــدگـــی سـلـــول (بـــه عـنـــوان مـثـــال چسبندگی سلول پاتوژن-میزبان)

کاربردها
ایـن تـکـنـولـوژی کـاربـردهـایـی در زمینه‌های مـخـتـلـف شامل بیولوژی مولکولی ، پاتولوژی ، ایـمـنـولـوژی ، زیـسـت شـنـاسی گیاهی و زیست شـنـاسـی دریـایـی دارد. کـاربـردهـای وسیعی در پـــزشــکـــی (بــه ویــژه در پـیــونــد ، هـمــاتــولــوژی ، ایـــمـــنـــــولــــوژی تــــومــــور و شــیــمــــی درمــــانــــی ، تـشـخـیـص‌هـای پـیـش از تولد ، ژنتیک و مرتب سازی اسپرم برای انتخاب جنسیت از قبل) دارد. در زیـسـت شـنـاسـی دریـایـی ، مـی‌تـوان خواص اتوفلورسنت پلانکتون فتوسنتز را با فلوسیتومتر به منظور توصیف ساختار اجتماعی و فراوانی اســتــخــــراج کــــرد. در مــهــنــــدســــی پـــروتــئــیـــن ، فلوسیتومتر در ترکیب با نمایشگر باکتریائی و نـمــایـشـگــر مـخـمــر بـرای شنـاسـایـی گـونـه‌هـای پـــروتـئـیـنــی cell surface-displayed بــا خــواص موردنظر استفاده می‌شود.

Flow Cytometry 06
مشکلات گزارش شده
تحلیل با استفاده از فلوسیتومتری نیازمند این اسـت کـه سـلـول‌هـا به صورت مجزا در حالت محلول قرار داشته باشند (یعنی هر سلول به وسیله یک ماتریس مایع احاطه شده باشد ، بدون این که سلول‌های همسایه در کنار آن جمع شده باشند.) خون ، مغز استخوان و کشت‌های سلولی به راحتی ، محلول‌های تک سلولی تشکیل می‌دهند. اما بافت جامد غیرلنفوئید نیاز به پردازش با استفاده از آنزیم یا عوامل (chelating) برای از بین بردن پیوندهای بین سلول‌ها دارد. متأسفانه این پردازش ، باقیمانده‌های سلولی (استرومای سلولی ، سیتو پلاسم و نوکلئوپلاسم آزاد) هم تولید می‌کند که در طول تحلیل ، اغتشاش ایجاد می‌کنند. با این وجود می‌توان با استفاده از تمایز و جبران الکترونیکی داده ها ، تأثیر این باقیمانده‌ها روی نتایج نهائی را از بین برد. 
برای این که فلوسیتومتر بتواند به صورت مؤثری کار کند ، نقطه تقاطع پرتو لیزر و جبران سلولی باید در رابطه با مسیر تشخیص ، دقیقاً حفظ شود. این پیکربندی خاص نیاز دارد که عملکرد به صورت روزانه بررسی شود تا از عملکرد مناسب دستگاه ، اطمینان حاصل شود.

Flow Cytometry 07
توصیه‌های خرید
توصیه‌های  ECRI
با توجه به کاربردهای متنوع بالینی دستگاه فلوسیتومتر ، خریداران باید نیازهای خود را ارزیابی کرده و دستگاه مناسب را بر اساس نیازهای خاص خود انتخاب کنند. 
در حــالــت کـلــی ECRI تــوصـیــه مــی‌کـنــد کــه فـلــوسـیـتـومتـرهـا بـایـد قـادر بـه انجـام immunophenotyping باشند. قابلیت‌های دیگر (به عنوان مثال پیوند ، DNA S-phase و میکروبیولوژی) اختیاری هستند و باید مطابق با نیازهای مکان خاصی که قرار است دسـتـگـاه در آن اسـتـفـاده شـود ، در نـظـر گـرفـتـه شـونـد. نیازمندی‌های طول موج برای فلوسیتومترها بر اساس تعداد رنگ‌های مورد استفاده در آنالیز متفاوت است. زمانی که با دو یا سه رنگ کار می‌شود ، طول موج nm 488 نیاز است. زمانی که با چهار یا شش رنگ کار می شود ، طول موج بالاتر نزدیک به nm 560 یا nm 640 ترجیح داده می‌شود. ECRI تـوانـایی خـوانـدن دو تـا سـه رنـگ را بـه عنوان یک نیازمندی اصلی در نظر می‌گیرد. دستگاه‌هایی که می‌توانند چهار رنگ را تشخیص دهند ، ترجیح داده می‌شوند و آنالیز شش رنگ هم باید اختیاری در نظر گرفته شود. 
ECRI توصیه می‌کند که قابلیت جدا سازی سلول به عنوان یک ویژگی اختیاری در نظر گرفته شود. خریداران نیاز دارند ارزیابی کنند که آیا قابلیت جدا سازی برای کار و نیازمندی‌های خاص آن‌ها الزامی است یا نه.  

ملاحظات دیگر 
از آنجا که عملکرد فلوسیتومتر نیاز به آموزش خــاص دارد ، تـولیـدکننـدگـان معمـولا آمـــوزش رایگـان ارائـه مـی‌دهنـد. بـا ایـن وجـود اپـــراتـــورهـــا بـــرای حـــرفـــه ای شـــدن ، نــیـــاز بـــه آمـوزش‌هـای اضـافـی و تجـربـه طـولانـی کار با دستگاه را دارند. بـه هـمـیـن دلـیـل در بـرخـی مـراکـز ، تـکـنـولـوژیـسـت‌هـای خـــاصـــی بـــرای کــار بــا فــلــــوســیـتـــومـتـــر در نـظـــر گـــرفـتـــه مـــی‌شـــونـــد. بیمارستان‌ها همچنین باید در این زمینه که نتایج چگونه مورد استفاده قرار خواهند گرفت و این کـه چـه تست‌هایی باید انجام شود ، با پزشکان ارتـبــاط داشـتــه بــاشـنــد. در هـنـگــام خــریـد یـک فلـوسیتـومتـر ، بـاید نیازمندی‌های پرسنل را نیز مدنظر قرار داد (به عنوان مثال آیا نیاز به استخدام یک پزشک یا تکنولوژیست باتجربه هست؟)
قیمت دستگاه بسته به سخت افزار و نرم افزار کــامـپـیــوتــر ، بـرنـامـه‌هـای مـوجـود در دستگـاه و موجود بودن واحدهای آماده سازی اتوماتیک نمونه و دیگر لوازم جانبی متفاوت است. از  آنجا کـه مـدل‌هـای بـا  قـابـلـیـت جـدا سازی سلول و بدون آن موجود هستند ، آزمایشگاه‌ها باید تعیین کنند که آیا به این قابلیت در حال حاضر نیاز دارند یا ممکن است در آینده به آن نیاز پیدا کنند. قیمت ایـن دسـتـگـاه‌هـا بـسـتـه بـه گزینه‌ها و پیکربندی دستگاه متغیر است.
از آنـجـا کــه فـلـوسـیـتـومـتـرهـا ، دسـتـگـاه‌هـای open-platform ای هستند ، معرف‌ها را می‌توان از تــولـیــدکـنـنــدگــان مـتـنــوعــی خــریــداری کــرد.  معیارهای دیگری که در خرید باید در نظر گرفته شوند ، گزینه‌های مربوط به چاپگر و کامپیوتر ، گزینه‌های نرم افزار DNA و ایمنوفلورسانس و ویژگی هایی مانند محدودکردن خطرات بیو و سردسازی هستند.
در ادامه یک آنالیز PV/LCC نمونه در آمریکا برای محاسبه هزینه تهیه یک فلوسیتومتر نوشته شده است:

فرضیات
– هزینه‌های عملکردی برای سال‌های یک تا پنج در نظر گرفته می‌شوند.
– ضریب کاهش دلار %۵/۳‌ است.
– نرخ تورم برای هزینه‌های پشتیبانی ۳% و برای مواد مصرفی ۳% است. 

هزینه‌های Capital
– سیستم: صد و چهل هزار دلار
– کل هزینه‌های Capital: صد و چهل هزار دلار

هزینه‌های عملکردی
– قرارداد سرویس ، دو تا پنج سال = چهارده هزار دلار در سال
– دستمزد و هزینه‌ها برای یک FTE = چهل هزار دلار در سال
– معرف‌ها = ۱۰۵ هزار دلار در سال
– کل هزینه‌های عملکردی = ۱۴۵ هزار دلار برای سال اول ؛ ۱۵۹ هزار دلار برای سال دوم تا پنجم.
– $۱۲۷‚۸۰۵=PV
هزینه‌های دیگری که در آنالیز بالا وارد نشده اند و باید برای برنامه ریزی بودجه در نظر گرفته شوند ، شامل موارد مرتبط با گزینه‌های زیر می‌شوند:
– ارتقاء نرم افزار که در گارانتی یا در قرارداد سرویس در نظر گرفته نشده اند.
Utilities  
– Contributions  to  overhead
همان طور که در مثال بالا از آنالیز PV/LCC نشان داده شد ، هزینه  خرید اولیه فقط کـســری از هـزینـه کلـی عملکـرد در طـول پنـج سـال اسـت. بنـابـرایـن بـه جـای ایـن کـه تصمیم‌گیری در مورد خرید تنها بر اساس هزینه اولیه یک سیستم فلوسیتومتر گرفته شود ، خریداران باید هزینه‌های عملکردی در طول عمر آن را نیز در نظر گرفته و بررسی کنند.

مراحل توسعه
کـاربـردهـای بـالـیـنـی فـلـوسـیـتـومـتـر در اواسـط دهـه ۱۹۷۰ شـروع شـد. پیشرفت در سیستم‌های الکترونیکی و افزوده شدن میکروپروسسورها به فلوسیتومترهای فعلی امکان ارزیابی حداقل هشت تا نه پارامتر سلولی را می‌دهد ؛ دو پارامتر پراکندگی نور ، سه یا چهار پارامتر chromogenic و سه پارامتر ایمنوفلورسانس.
به علاوه امروزه بسیاری از فلوسیتومترها ، مجهز به دو یا چند لیزر هستند که می‌توانند بـرای بـرانـگـیـختن یک بازه از رنگ‌ها و فلئوروکروم‌ها استفاده شوند. این پیشرفت تکنولوژی برای اپراتورها امکان استفاده همزمان از ۱۱ رنگ ایمنوفلورسانس را فراهم می‌کند. 
به منظور بهبود دادن کلاس بندی ، دریافت و آنالیز داده ، نرم افزار آنالیز داده  به طور دائم به روز شده و توسعه داده می‌شود. به علاوه استفاده از سیستم‌های آماده سازی اتـومـاتیک نمونه ، موجب استانداردسازی آماده سازی و فراهم کردن کنترل کیفیت خوب می‌شود و زمان آماده سازی را  از یک تا دو ساعت به ۱۰‌ دقیقه یا کمتر کاهش مـی‌دهـد. محققـان نشان داده‌اند که تکنولوژی فلوسیتومتر با استفاده از منابع نوری ارزان قیمت هــلــیــــم-نــئـــون و تـکـنـیـــک هـــای رنـــگ آمـیـــزی فـلـورسـانـس می‌توانند ابزاری حساس ، از نظر هزینه مقرون به صرفه و سریع برای تشخیص ، توصیف و شناسایی باکتری ها باشند.  ‌امروزه ، یــکـــی از مـــرســوم تــریــن کــاربــردهــای بــالـیـنــی فلوسیتومتر انجام شمارش لنفوسیت ۸/CD4CD در خــون محیطـی از بیمـاران بـا HIV مثبت برای سـطــح بـنــدی و بـرای نـظـارت دوره ای اســت. تـحـقیقـاتـی بـا هـدف مطـالعـه پلاکت‌ها به ویـژه بــــرای تــشــخــیـــص آنــتـــی بـــادی ضـــدپـــلاکــتــی مـــرتــبـــط بــا بـیـمــاری هــای خــود ایـمـنــی انـجــام مـی‌شـونـد. یـکـی دیـگـر از زمینه‌های تحقیقاتی مورد علاقه ، فعال سازی پلاکت است که زمانی که خون با پروتز رگ یا سطح یک وسیله پزشکی مـانـنـد واحـد هـمودیالیز یا بای پس شش-قلب تـمـاس پـیدا می کند ، اتفاق می‌افتد. آنالیز DNA سـلــول تــومـور  و نـیـز بـسـیـاری از کـاربـردهـای میکروبیولوژی بالینی دیگر برای فلوسیتومتر با افزایش مداوم استفاده از این دستگاه ، در حال بررسی است.
محققـان شـروع به بررسی امکان استفاده از فلوسیتومترها به عنوان آشکارسازهای ویروس کـــرده انـــد. ویـــروس‌هــا بـسـیــار کــوچــک‌تــر از بـاکتری‌ها یا سلول‌های سرطانی با قطر ۱۰۰ تا ۲۵۰ نــانــومـتــر هـسـتـنــد. انـدازه کـوچـک آن هـا ، تفکیک کردن سیگنال‌های نور پراکنده شده از آن‌هـا از نـویـز پـس زمـیـنـه را مـشـکـل مـی‌سازد. هـــم‌زمـــان بـــا تـــلاش مــحـقـقــان بــرای افــزایــش حساسیت فلوسیتومترها ، نقش این دستگاه‌ها به عنوان آشکارساز ویروس پررنگ تر می‌شود.

منبع: ماهنامه مهندسی پزشکی

اخبار مرتبط


ارسال دیدگاه